សំណុំ PCR (MSP) Methylation-specipc

គំរូ A-1

template ពុម្ពមានផ្ទុកនូវសារធាតុមិនបរិសុទ្ធប្រូតេអ៊ីនឬតាឃ្យូអ៊ីនអ៊ីស្យូស។

■ភាពមិនត្រឹមត្រូវនៃពុម្ពគឺមិនពេញលេញទេ - បង្កើនសីតុណ្ហាភាព denaturation ត្រឹមត្រូវនិងពន្យារពេល denaturation ។

rad ការបំផ្លាញគំរូ —— រៀបចំគំរូឡើងវិញ។

A-2 Primer

quality គុណភាពអឹមមឺរ-សំយោគ primer ឡើងវិញ។

rad ការបំផ្លាញសារធាតុ Primer —— បញ្ជូលសារធាតុ primers ដែលមានកំហាប់ខ្ពស់ទៅជាបរិមាណតូចដើម្បីរក្សាទុក។ ជៀសវាងការកកនិងការរលាយច្រើនឬរយៈពេលយូរ ៤ អង្សាសេ។

design ការរចនាមិនត្រឹមត្រូវនៃ primers (ឧទាហរណ៍ប្រវែង primer មិនគ្រប់គ្រាន់, dimer បង្កើតឡើងរវាង primers ។

អេ-៣ មីលីក្រាម²⁺ការផ្តោតអារម្មណ៍

Mg²⁺ កំហាប់ទាបពេក - បង្កើនមីលីក្រាមត្រឹមត្រូវ²⁺ កំហាប់៖ បង្កើនប្រសិទ្ធភាពមីលីក្រាម²⁺ ការប្រមូលផ្តុំដោយប្រតិកម្មជាបន្តបន្ទាប់ពី ១ មីល្លីម៉ែត្រទៅ ៣ មីល្លីម៉ែត្រដោយមានចន្លោះពេល ០.៥ មីល្លីម៉ែត្រដើម្បីកំណត់មីល្លីមល្អបំផុត²⁺ ការផ្តោតអារម្មណ៍សម្រាប់គំរូនិង primer នីមួយៗ។

A-4 សីតុណ្ហភាពកំដៅ

temperature សីតុណ្ហាភាពចំហេះខ្ពស់ជះឥទ្ធិពលដល់ការចងទ្រនាប់ទ្រនាប់ទ្រនាប់និងពុម្ព។ - បន្ថយសីតុណ្ហភាពដុតនិងបង្កើនប្រសិទ្ធភាពលក្ខខណ្ឌដោយជម្រាល ២ អង្សាសេ

A-5 ពេលវេលាពន្យាពេល

extension រយៈពេលពន្យាពេលខ្លី - បង្កើនពេលវេលាបន្ថែម។

បាតុភូត៖ គំរូអវិជ្ជមានក៏បង្ហាញពីក្រុមតន្រ្តីលំដាប់គោលដៅផងដែរ។

ក -១ ការចម្លងរោគ PCR

■ឆ្លងកាត់ការចម្លងរោគនៃលំដាប់គោលដៅឬផលិតផលពង្រីក - ប្រយ័ត្នកុំដាក់បំពង់ដែលមានលំដាប់គោលដៅនៅក្នុងគំរូអវិជ្ជមានឬកំពប់វាចេញពីបំពង់ centrifuge ។ ទឹកថ្នាំឬឧបករណ៍គួរតែត្រូវបានស្វ័យប្រវត្តិដើម្បីកំចាត់អាស៊ីតនុយក្លេអ៊ែរដែលមានស្រាប់ហើយអត្ថិភាពនៃការចម្លងរោគគួរតែត្រូវបានកំណត់តាមរយៈការពិសោធន៍ត្រួតពិនិត្យអវិជ្ជមាន។

ination ការចម្លងរោគនៃសារធាតុ - - កំចាត់សារធាតុគីមីហើយរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាពទាប។

A-2 នាយករដ្ឋមន្រ្តីr

Mg²⁺ កំហាប់ទាបពេក - បង្កើនមីលីក្រាមត្រឹមត្រូវ²⁺ កំហាប់៖ បង្កើនប្រសិទ្ធភាពមីលីក្រាម²⁺ ការប្រមូលផ្តុំដោយប្រតិកម្មជាបន្តបន្ទាប់ពី ១ មីល្លីម៉ែត្រទៅ ៣ មីល្លីម៉ែត្រដោយមានចន្លោះពេល ០.៥ មីល្លីម៉ែត្រដើម្បីកំណត់មីល្លីមល្អបំផុត²⁺ ការផ្តោតអារម្មណ៍សម្រាប់គំរូនិង primer នីមួយៗ។

design ការរចនាបឋមមិនត្រឹមត្រូវហើយលំដាប់គោលដៅមានភាពដូចគ្នាជាមួយនឹងលំដាប់មិនកំណត់គោលដៅ។ —- ការរចនាបឋមឡើងវិញ។

បាតុភូត៖ ក្រុមតន្រ្តីពង្រីក PCR មិនត្រូវគ្នានឹងទំហំរំពឹងទុកទាំងធំឬតូចឬពេលខ្លះទាំងក្រុមតន្រ្តីពង្រីកជាក់លាក់និងក្រុមតន្រ្តីពង្រីកដែលមិនជាក់លាក់។

អេ-១ មេ

■លក្ខណៈពិសេសបឋមខ្សោយ

—- ការរចនាបឋមឡើងវិញ។

concentration កំហាប់បឋមខ្ពស់ពេក - បង្កើនសីតុណ្ហាភាព denaturation ត្រឹមត្រូវនិងពន្យារពេល denaturation ។

ក -២ មីលីក្រាម²⁺ ការផ្តោតអារម្មណ៍

លោក Mg²⁺ កំហាប់ខ្ពស់ពេក - កាត់បន្ថយកំហាប់ Mg2+ ត្រឹមត្រូវ៖ បង្កើនប្រសិទ្ធភាព Mg²⁺ ការប្រមូលផ្តុំដោយប្រតិកម្មជាបន្តបន្ទាប់ពី ១ មីល្លីម៉ែត្រទៅ ៣ មីល្លីម៉ែត្រដោយមានចន្លោះពេល ០.៥ មីល្លីម៉ែត្រដើម្បីកំណត់មីល្លីមល្អបំផុត²⁺ ការផ្តោតអារម្មណ៍សម្រាប់គំរូនិង primer នីមួយៗ។

អេ -៣ ប៉ូលីមេរ៉េសដែលអាចធ្វើឱ្យកម្តៅបាន

amount បរិមាណអង់ស៊ីមលើស - កាត់បន្ថយចំនួនអង់ស៊ីមឱ្យបានត្រឹមត្រូវនៅចន្លោះពេល ០.៥ យូ។

A-4 សីតុណ្ហភាពកំដៅ

temperature សីតុណ្ហាភាពនៃការផ្សាភ្ជាប់ទាបពេក-បង្កើនសីតុណ្ហភាពដុតដោយត្រឹមត្រូវឬប្រើវិធីដុតពីរដំណាក់កាល

វដ្ត A-5 PCR

cy វដ្ត PCR ច្រើនពេក - កាត់បន្ថយចំនួនវដ្ត PCR ។

អេ-១ មេ—— ភាពជាក់លាក់មិនល្អ —— រចនាឡើងវិញនូវថ្នាំ primer ផ្លាស់ប្តូរទីតាំងនិងប្រវែងរបស់ primer ដើម្បីបង្កើនភាពជាក់លាក់របស់វា។ ឬអនុវត្ត PCR ដែលមានសំបុក

អេ -២ គំរូឌីអិនអេ

—— ពុម្ពមិនសុទ្ធ —— សម្អាតពុម្ពឬដកឌីអិនអេជាមួយឧបករណ៍បន្សុទ្ធ។

អេ-៣ មីលីក្រាម²⁺ ការផ្តោតអារម្មណ៍

- មីង²⁺ កំហាប់ខ្ពស់ពេក - កាត់បន្ថយមីលីក្រាមឱ្យបានត្រឹមត្រូវ²⁺ កំហាប់៖ បង្កើនប្រសិទ្ធភាពមីលីក្រាម²⁺ ការប្រមូលផ្តុំដោយប្រតិកម្មជាបន្តបន្ទាប់ពី ១ មីល្លីម៉ែត្រទៅ ៣ មីល្លីម៉ែត្រដោយមានចន្លោះពេល ០.៥ មីល្លីម៉ែត្រដើម្បីកំណត់មីល្លីមល្អបំផុត²⁺ ការផ្តោតអារម្មណ៍សម្រាប់គំរូនិង primer នីមួយៗ។

អេ -៤ ឌីអិនធីភី

—— កំហាប់ dNTPs ខ្ពស់ពេក —— កាត់បន្ថយកំហាប់ dNTP ឱ្យបានសមស្រប

A-5 សីតុណ្ហភាពកំដៅ

- - សីតុណ្ហាភាពនៃការដុតទាបពេក - បង្កើនសីតុណ្ហភាពដុតដោយត្រឹមត្រូវ

ក -៦ វដ្ត

—— វដ្តច្រើនពេក —— បង្កើនចំនួនវដ្ត

ជំហានដំបូងគឺត្រូវជ្រើសរើសប៉ូលីមេរ៉េសដែលសមស្រប។ តាម៉ីប៉ូលីមែរស្យុងធម្មតាមិនអាចពិនិត្យឡើងវិញបានទេដោយសារខ្វះសកម្មភាព ៣-៥ 'ហើយភាពមិនត្រូវគ្នានឹងកាត់បន្ថយប្រសិទ្ធភាពផ្នែកបន្ថែមយ៉ាងខ្លាំង។ ហេតុនេះហើយបានជាតាម៉ីប៉ូលីមែរស្យុងធម្មតាមិនអាចពង្រីកបំណែកគោលដៅធំជាង ៥ គីឡូបៃប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពឡើយ។ Taq polymerase ជាមួយនឹងការកែប្រែពិសេសឬ polymerase ភាពស្មោះត្រង់ខ្ពស់ផ្សេងទៀតគួរតែត្រូវបានជ្រើសរើសដើម្បីបង្កើនប្រសិទ្ធភាពផ្នែកបន្ថែមនិងបំពេញតម្រូវការនៃការពង្រីកបំណែកវែង។ លើសពីនេះការពង្រីកបំណែកវែងៗក៏តម្រូវឱ្យមានការកែតម្រូវដែលត្រូវគ្នានៃការរចនាបឋមពេលវេលាកំណត់ពេលវេលាការពន្យារពេល pH បណ្តោះអាសន្ន។ ល។ ដើម្បីបងា្ករការបំផ្លាញគំរូពេលវេលានៃការបដិសេធនៅ ៩៤ អង្សាសេគួរតែត្រូវបានកាត់បន្ថយមកត្រឹម ៣០ វិនាទីឬតិចជាងនេះក្នុងមួយវដ្តហើយពេលវេលាដើម្បីបង្កើនសីតុណ្ហភាពដល់ ៩៤ អង្សាសេមុនពេលពង្រីកគួរតែតិចជាង ១ នាទី។ លើសពីនេះការកំណត់សីតុណ្ហភាពផ្នែកបន្ថែមនៅប្រហែល ៦៨ អង្សាសេនិងការរចនាពេលវេលាបន្ថែមយោងតាមអត្រា ១ គីប/នាទីអាចធានានូវការពង្រីកប្រសិទ្ធិភាពនៃបំណែកវែង។

អត្រាកំហុសនៃការពង្រីក PCR អាចត្រូវបានកាត់បន្ថយដោយប្រើឌីអិនអេប៉ូលីមែរជាច្រើនដែលមានភាពស្មោះត្រង់ខ្ពស់។ ក្នុងចំណោមតាមិលឌីអិនអេប៉ូលីមែរទាំងអស់ដែលបានរកឃើញរហូតមកដល់ពេលនេះអង់ស៊ីមភីហ្វូមានអត្រាកំហុសទាបបំផុតនិងភាពស្មោះត្រង់ខ្ពស់បំផុត (សូមមើលតារាងភ្ជាប់) ។ បន្ថែមពីលើការជ្រើសរើសអង់ហ្ស៊ីមអ្នកស្រាវជ្រាវអាចកាត់បន្ថយអត្រាផ្លាស់ប្តូរ PCR បន្ថែមដោយធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវលក្ខខណ្ឌប្រតិកម្មរួមទាំងការធ្វើឱ្យប្រសើរនូវសមាសភាពសតិបណ្ដោះអាសន្នការផ្តោតអារម្មណ៍នៃប៉ូលីមេរ៉េសដែលអាចទ្រាំទ្របាននិងបង្កើនចំនួនវដ្ត PCR ។