កញ្ចប់ FastKing RT (ជាមួយ gDNase)

A-1 RNA ត្រូវបានបំផ្លាញ

- សម្អាត RNA ដែលមានគុណភាពខ្ពស់ដោយគ្មានការចម្លងរោគ សម្ភារៈដែល RNA ត្រូវបានស្រង់ចេញគួរតែស្រស់តាមដែលអាចធ្វើទៅបានដើម្បីការពារការរិចរិលរបស់ RNA ។ វិភាគភាពសុចរិតរបស់ RNA នៅលើជែលដែលមិនមានលក្ខណៈត្រឹមត្រូវមុនពេលប្រតិកម្មរបស់ RT បន្ទាប់ពីការស្រង់ចេញ RNA វាគួរតែត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងទម្រង់ ១០០% ។ ប្រសិនបើ RNase inhibitor ត្រូវបានប្រើសីតុណ្ហាភាពកំដៅគួរតែ <45 C ហើយ pH គួរតែតិចជាង 8.0 បើមិនដូច្នេះទេអ្នករារាំងនឹងបញ្ចេញ RNase ដែលបានកំណត់ទាំងអស់។ លើសពីនេះថ្នាំ RNase inhibitor គួរតែត្រូវបានបន្ថែមនៅក្នុងដំណោះស្រាយដែលមាន≥ 0.8 mM DTT ។

អេ -២ អរអេនអេមានផ្ទុកសារធាតុរារាំងប្រតិកម្មចម្លងបញ្ច្រាស

- —Reverse transcription inhibitors រួមមាន SDS, EDTA, glycerol, sodium pyrophosphate, spermidine, formamide, guanidine អំបិល។ លាងទឹកភ្លៀង RNA ជាមួយអេតាណុល ៧០% (v/v) ដើម្បីកំចាត់សារធាតុរារាំង។

អេ -៣ ការស្រោបជ័រមិនគ្រប់គ្រាន់នៃសារធាតុបឋមប្រើសម្រាប់សំយោគខ្សែទីមួយនៃស៊ីឌីអេនអេ

- កំណត់ថាសីតុណ្ហាភាពនៃការដុតគឺសមរម្យសម្រាប់ថ្នាំទ្រនាប់ដែលប្រើក្នុងពិសោធន៍។ ចំពោះ hexamers ចៃដន្យវាត្រូវបានគេណែនាំឱ្យរក្សាសីតុណ្ហភាពនៅ ២៥ អង្សាសេរយៈពេល ១០ នាទីមុនពេលឈានដល់សីតុណ្ហភាពប្រតិកម្ម។ សម្រាប់ប្រូហ្សេមជាក់លាក់ហ្សែន (ជីអេសភី) សូមសាកល្បងជីអេសភីអេសផ្សេងទៀតឬប្តូរទៅអូលីហ្គូ (ឌីធី) ឬហេកសាម័រចៃដន្យ។

A-4 ចំនួនតូចនៃការចាប់ផ្តើម RNA

- បង្កើនបរិមាណ RNA ចំពោះសំណាក RNA តិចជាង ៥០ ng, ០.១ μgទៅ ០.៥ μg acetyl BSA អាចត្រូវបានប្រើនៅក្នុងការសំយោគ cDNA ខ្សែទីមួយ

A-5 លំដាប់គោលដៅមិនត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងជាលិកាដែលបានវិភាគទេ។

- សាកល្បងជាលិកាផ្សេងទៀត។

A-6 ប្រតិកម្ម PCR បរាជ័យ

-សម្រាប់ RT-PCR ពីរជំហានគំរូគំរូ cDNA នៅក្នុងជំហាន PCR មិនអាចលើសពី ១/៥ នៃបរិមាណប្រតិកម្ម។

អេ -១ ការដុតកំរាលព្រំនិងគំរូមិនជាក់លាក់

—— ទ្រនាប់ទ្រនាប់ទ្រនាប់ទី ៣ ចុងមិនគួរមាន ២-៣ ឌីជីឬឌីស៊ីទេ។ ប្រើទ្រឹស្តីបទហ្សែនជាក់លាក់នៅក្នុងការសំយោគខ្សែទីមួយជំនួសឱ្យការបង្កើតចៃដន្យឬអូលីហ្គូ (ឌីធី) ។ ប្រើសីតុណ្ហាភាពដុតខ្ពស់ជាងនៅក្នុងវដ្តពីរបីដំបូងហើយបន្ទាប់មកសីតុណ្ហភាពដុតទាបជាង។ ប្រើតាកអេនឌីអេនប៉ូលីមេរ៉េសសម្រាប់កុំព្យូទ័រដើម្បីបង្កើនភាពជាក់លាក់នៃប្រតិកម្ម។

ក -២ ការរចនាអន់នៃប្រូហ្សេមជាក់លាក់ហ្សែន

- - អនុវត្តតាមគោលការណ៍ដូចគ្នាសម្រាប់ការរចនាបឋមបន្ថែម។

A-3 RNA កខ្វក់ជាមួយ DNA ហ្សែន

—— ព្យាបាល RNA ជាមួយ PCR-grade DNase I. រៀបចំប្រតិកម្មត្រួតពិនិត្យដោយគ្មានការចម្លងបញ្ច្រាសដើម្បីរកមើលការចម្លងរោគឌីអិនអេ។

A-4 ការបង្កើត primer dimer

—— ការរចនាបឋមដោយគ្មានការបូកបញ្ចូលគ្នានៅចុងទី ៣ ។

A-5 Mg ខ្ពស់ពេក²⁺ ការផ្តោតអារម្មណ៍

- បង្កើនប្រសិទ្ធភាព Mg²⁺ ការផ្តោតអារម្មណ៍សម្រាប់គំរូនីមួយៗនិងការរួមបញ្ចូលគ្នានៃ primer

អេ -៦ កខ្វក់ជាមួយឌីអិនអេបរទេស

-ប្រើគន្លឹះដែលធន់នឹងការសាយសត្វនិងអង់ស៊ីម UDG

A-1 ខ្លឹមសារនៃផលិតផលខ្សែទីមួយគឺខ្ពស់ពេក

- - កាត់បន្ថយបរិមាណផលិតផលខ្សែសង្វាក់ដំបូងនៅក្នុងជំហានប្រតិកម្ម PCR ធម្មតា។

អេ -២ បរិមាណបឋមខ្ពស់ពេកនៅក្នុងប្រតិកម្ម PCR

- កាត់បន្ថយការបញ្ចូលថ្នាំ primer

ក -៣ វដ្តច្រើនពេក

- - ធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវលក្ខខណ្ឌប្រតិកម្ម PCR និងកាត់បន្ថយចំនួនវដ្ត PCR ។

អេ -៤ សីតុណ្ហាភាពដុតទាបពេក

--បង្កើនសីតុណ្ហភាពដុតដើម្បីការពារការចាប់ផ្តើមនិងការពន្យារពេលមិនជាក់លាក់

អេ -៥ ការពង្រីកមិនជាក់លាក់នៃបំណែកអូលីហ្គូនូក្លូតតៃតដែលបង្កើតឡើងដោយការរិចរិលឌីអិនអេសអេនអេ-ដកអរអិនអេអេដែលមានគុណភាពខ្ពស់ដើម្បីការពារការចម្លងឌីអិនអេ។

RT-PCR គឺដើម្បីបញ្ចូនប្រតិចារឹក RNA ទៅជា cDNA ហើយបន្ទាប់មកប្រើ cDNA ដែលបានចម្លងបញ្ច្រាសធ្វើជាគំរូសម្រាប់ប្រតិកម្ម PCR ដើម្បីពង្រីកបំណែកគោលដៅ។ ជ្រើសរើសយក primers ចៃដន្យ, Oligo dT និង primers ជាក់លាក់ហ្សែនយោងតាមលក្ខខណ្ឌជាក់លាក់នៃការពិសោធន៍។ ថ្នាំទ្រនាប់ខាងលើទាំងអស់អាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់កោសិកាអេក្រារីយ៉ូត mRNA ខ្លីដោយគ្មានរចនាសម្ព័ន្ធទ្រនាប់សក់។

primer ចៃដន្យ៖ ស័ក្តិសមនឹង RNA វែងដែលមានរចនាសម្ព័នរោមក៏ដូចជាប្រភេទ RNA គ្រប់ប្រភេទដូចជា rRNA, mRNA, tRNA ។

អូលីហ្គូឌីធីធី៖ ស័ក្តិសមនឹងអរអេនអេនអេដែលមានកន្ទុយប៉ូលីអេអេ (ប្រូអេការីយ៉ូតអរអិនអេយូហ្គីរីយ៉ូតអូលីហ្គូឌីធីធីអរអរអេនអេនិងធីអរអរអេនអេមិនមានកន្ទុយប៉ូលីអេ) ដោយសារអូលីហ្គោឌីធីត្រូវបានភ្ជាប់ទៅនឹងកន្ទុយប៉ូលីអេអេគុណភាពនៃសំណាកអរអិនអេត្រូវបានទាមទារខ្ពស់ហើយសូម្បីតែការរិចរិលបន្តិចបន្តួចនឹងកាត់បន្ថយបរិមាណសំយោគស៊ីឌីអេនអេពេញប្រវែងយ៉ាងខ្លាំង។

បឋមជាក់លាក់ហ្សែន៖ បំពេញបន្ថែមតាមលំដាប់គំរូសមស្របសម្រាប់ស្ថានភាពដែលលំដាប់គោលដៅត្រូវបានគេដឹង។

មានវិធីពីរយ៉ាង៖

១. វិធីសាស្ត្រយោងផ្ទៃក្នុង៖ តាមទ្រឹស្តីស៊ីឌីអិនអេគឺជាបំណែកឌីអិនអេដែលមានប្រវែងខុសៗគ្នាដូច្នេះលទ្ធផលអេឡិចត្រូលីតត្រូវលាប។ ប្រសិនបើភាពសំបូរបែបរបស់ RNA មានកម្រិតទាបគ្មានផលិតផលណាមួយនឹងត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុង electrophoresis ទេប៉ុន្តែនេះមិនមានន័យថាគ្មានផលិតផលណាមួយនឹងត្រូវបានពង្រីកដោយ PCR ទេ។ ជាទូទៅឯកសារយោងផ្ទៃក្នុងអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីរកឃើញស៊ីឌីអេនអេ។ ប្រសិនបើឯកសារយោងផ្ទៃក្នុងមានលទ្ធផលគុណភាពនៃស៊ីឌីអិនអេអាចត្រូវបានធានាជាមូលដ្ឋាន (ក្នុងករណីខ្លះប្រសិនបើបំណែកហ្សែនគោលដៅវែងពេកអាចមានករណីលើកលែង) ។

2. ប្រសិនបើមានហ្សែនដែលគេស្គាល់បានពង្រីកដោយគំរូនេះវាអាចត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយបឋមនៃហ្សែននេះ។ ការពង្រីកឯកសារយោងផ្ទៃក្នុងមិនចាំបាច់មានន័យថាមិនមានបញ្ហាជាមួយ cDNA ទេ។ ដោយសារឯកសារយោងខាងក្នុងមានភាពសំបូរបែបនៅក្នុងស៊ីឌីអេនអេវាងាយស្រួលក្នុងការពង្រីក។ ប្រសិនបើស៊ីឌីអេនអេត្រូវបានរិចរិលផ្នែកខ្លះដោយសារហេតុផលផ្សេងៗតាមទស្សនៈប្រូបាប៊ីលីតេលទ្ធផល PCR នៃហ្សែនគោលដៅមានកំរិតទាបនឹងត្រូវប៉ះពាល់យ៉ាងខ្លាំង។ ខណៈពេលដែលសេចក្តីយោងផ្ទៃក្នុងនៅតែមានច្រើននៅឡើយការពង្រីកប្រហែលជាមិនត្រូវបានប៉ះពាល់ទេ។

ធ្វើឱ្យខូចផ្នែកខ្លះនៃ RNA ។ រកឃើញភាពសុចរិតនិងបន្សុទ្ធ RNA

មាតិកា RNA នៃប្រភេទផ្សេងៗគ្នាអាចមានភាពខុសប្លែកគ្នាប៉ុន្តែជាទូទៅ RNA សរុបដែលស្រង់ចេញគួរតែមានក្រុមតន្រ្តី 28S និង 18S ច្បាស់លាស់នៅក្នុងជែលអេឡិចត្រូលីតហើយពន្លឺរបស់អតីតក្រុមតន្រ្តីគួរតែខ្ពស់ជាងពីរដង។ ក្រុមតន្រ្តី 5S បង្ហាញថា RNA ត្រូវបានរិចរិលហើយពន្លឺរបស់វាគឺសមាមាត្រទៅនឹងកំរិតនៃការរិចរិល។ ការពង្រីកសេចក្តីយោងផ្ទៃក្នុងដោយជោគជ័យមិនមានន័យថាមិនមានបញ្ហាជាមួយ RNA ទេពីព្រោះឯកសារយោងខាងក្នុងមានច្រើន RNA អាចត្រូវបានពង្រីកដរាបណាការរិចរិលមិនធ្ងន់ធ្ងរ។ អូឌី₂₆₀/អូឌី₂₈₀សមាមាត្រនៃ RNA សុទ្ធដែលវាស់ដោយឧបករណ៍វាស់ស្ទង់គួរស្ថិតនៅចន្លោះ ១.៩ និង ២.១ ។ ចំនួនតិចតួចនៃភាពមិនបរិសុទ្ធនៃប្រូតេអ៊ីននៅក្នុង RNA នឹងកាត់បន្ថយសមាមាត្រ។ ដរាបណាតម្លៃមិនទាបពេក RT នឹងមិនប៉ះពាល់ទេ។ អ្វីដែលសំខាន់បំផុតសម្រាប់ RT គឺសុចរិតភាព RNA ។

ការពង្រីកហ្សែនឯកសារយោងផ្ទៃក្នុងអាចបង្ហាញថា RT ទទួលបានជោគជ័យប៉ុន្តែវាមិនចាំបាច់ទាក់ទងនឹងគុណភាពនៃខ្សែស៊ីឌីអេនអេទេ។ ដោយសារបំណែកឯកសារយោងខាងក្នុងជាទូទៅមានទំហំតូចនិងមានកន្សោមខ្ពស់ពួកគេងាយនឹងទទួលបានជោគជ័យក្នុងការចម្លងបញ្ច្រាស។ ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយទំហំនិងការបញ្ចេញហ្សែនគោលដៅប្រែប្រួលពីហ្សែនទៅហ្សែន។ គុណភាព cDNA មិនអាចត្រូវបានវិនិច្ឆ័យដោយការយោងផ្ទៃក្នុងជាពិសេសចំពោះបំណែកគោលដៅដែលវែងជាង ២ ខេប។

សំណាកខ្លះមានរចនាសម្ព័ន្ធស្មុគស្មាញបន្ទាប់បន្សំឬមានមាតិកា GC សម្បូរបែបឬមានតម្លៃជាមួយនឹងភាពសំបូរបែបទាប។ ក្នុងករណីទាំងនេះ transcriptase បញ្ច្រាសសមស្របគួរតែត្រូវបានជ្រើសរើសអាស្រ័យលើទំហំនៃបំណែកគោលដៅនិងគំរូ។ សម្រាប់ពុម្ព RNA ដែលមានមាតិកា GC ខ្ពស់និងរចនាសម្ព័ន្ធអនុវិទ្យាល័យស្មុគស្មាញវាពិបាកក្នុងការបើករចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៅសីតុណ្ហភាពទាបឬជាមួយ transcriptase បញ្ច្រាសទូទៅ។ ចំពោះពុម្ពទាំងនេះការបញ្ច្រាស Quant Reverse Transcriptase អាចត្រូវបានជ្រើសរើសព្រោះដំណើរការនៃការចម្លងបញ្ច្រាសរបស់វាគឺប្រសើរជាងស៊េរី M-MLV ស៊េរី transcriptase បញ្ច្រាសដែលអាចបញ្ច្រាសការចម្លងគំរូ RNA ផ្សេងៗប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពនិងចម្លង RNA ទៅក្នុងខ្សែអក្សរដំបូង cDNA ក្នុងកម្រិតអតិបរមា។ នៅពេលប្រើឧបករណ៍ចម្លងបញ្ច្រាសទូទៅប្រព័ន្ធ ២០ l អាចបញ្ច្រាស់ប្រតិចារឹកបាន ១ μgនៃ RNA សរុប។ សូមយកចិត្តទុកដាក់ចំពោះសមត្ថភាព RT អតិបរមានៃឧបករណ៍។ ប្រសិនបើពុម្ពត្រូវបានបន្ថែមលើសកំណត់ការបញ្ជូនបញ្ច្រាសនឹងពេញចិត្ត RNA ដែលមានច្រើន ដូច្នេះយកល្អកុំឱ្យលើសពីសមត្ថភាពអតិបរមារបស់ប្រព័ន្ធ។

A-1 កំណត់ថាតើ RNA ត្រូវបានបំផ្លាញយ៉ាងធ្ងន់ធ្ងរហើយប្រសិនបើ RT ទទួលបានជោគជ័យ

ជាទូទៅហេតុផលសម្រាប់ការបរាជ័យនៃការពង្រីកការពង្រីកផ្ទៃក្នុងជារឿយៗបណ្តាលមកពីការរិចរិល RNA ធ្ងន់ធ្ងរ។ មូលហេតុមួយទៀតដែលអាចជាការបរាជ័យនៃការចម្លងបញ្ច្រាស។ ឯកសារយោងផ្ទៃក្នុងមិនអាចប្រើជាស្តង់ដារដើម្បីវិនិច្ឆ័យគុណភាពខ្សែតែមួយរបស់ស៊ីឌីអេនអេទេប៉ុន្តែវាអាចប្រើជាស្តង់ដារដើម្បីវិនិច្ឆ័យថាតើការចម្លងបញ្ច្រាសជោគជ័យដែររឺទេប្រសិនបើមិនមានបញ្ហាគុណភាពអរអេនអេ អ្វីដែលសំខាន់បំផុតនៅក្នុងដំណើរការបញ្ចូនបញ្ច្រាសគឺរក្សាសីតុណ្ហភាពថេរនិងប្រព័ន្ធប្រតិកម្មថេរដើម្បីបង្កើនប្រសិទ្ធភាពប្រតិកម្ម។

ក -២ កំណត់ថាតើថ្នាំទ្រនាប់សម្រាប់ពង្រីកហ្សែនយោងផ្ទៃក្នុងអាចទុកចិត្តបានដែរឬទេហើយប្រសិនបើមានបញ្ហាជាមួយនឹងសារធាតុប្រតិកម្មដែលប្រើក្នុង PCR ។

ចំពោះបរិមាណដែលទាក់ទង RNA ត្រូវតែត្រូវបានកំណត់បរិមាណមុនពេលធ្វើប្រតិចារិកបញ្ច្រាសដែលត្រូវបានទាមទារនៅក្នុងឧបករណ៍ចម្លងបញ្ច្រាសជាច្រើនឧទាហរណ៍កំណត់បរិមាណបញ្ចូល RNA ជា ១ μg។ ដោយសារស៊ីឌីអិនដែលបានបញ្ច្រាស់បញ្ច្រាសគឺជាដំណោះស្រាយចម្រុះរួមទាំងអរអេនអេអូលីហ្គូឌីធីអង់ហ្ស៊ីមឌីអិនភីភីនិងសូម្បីតែសំណល់ឌីអិនអេតិចតួចការគម្លាតនឹងកើតឡើងដូច្នេះវាមិនអាចកំណត់បរិមាណស៊ីឌីអិនបានត្រឹមត្រូវទេ។ ដូច្នេះបរិមាណ RNA គឺចាំបាច់។ ដោយគិតពីប្រសិទ្ធភាពនៃការចម្លងបញ្ច្រាសគឺដូចគ្នាក្នុងចំណោមសំណាកខុសៗគ្នាបរិមាណស៊ីឌីអេនអេដែលទទួលបានគួរតែដូចគ្នាហើយការវិភាគបរិមាណអាចបង្ហាញពីការប្រៀបធៀបកម្រិតនៃការបញ្ចេញហ្សែនផ្សេងៗគ្នាក្នុងចំនួនសរុបនៃអរអេនអេ។ នៅពេលសម្តែង PCR បរិមាណហ្វ្លុយហ្សែហ្សែនដែលទាក់ទង, ស៊ីឌីអិនអេបរិមាណអាចមិនត្រូវបានទាមទារបន្ទាប់ពីការចម្លងបញ្ច្រាសទេពីព្រោះហ្សែនយោងខាងក្នុងអាចត្រូវបានដើរតួជាឯកសារយោង។

វាត្រូវបានទាក់ទងជាចម្បងទៅនឹងហ្សែនហើយការចម្លងបញ្ច្រាសនៃបំណែកវែងមិនអាចធ្វើទៅបានសម្រាប់ហ្សែនភាគច្រើនទេ។ ទីមួយប្រសិទ្ធភាពនៃការចម្លងបញ្ច្រាសគឺទាបជាង PCR ឆ្ងាយណាស់។ ទីពីរតំបន់សម្បូរជីស៊ីនិងរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៃហ្សែនជាច្រើនកំណត់ទាំងការចម្លងបញ្ច្រាសនិង PCR ។ ជាចុងក្រោយភាពស្មោះត្រង់និងប្រសិទ្ធភាពនៃការបង្កើន PCR មានការលំបាកក្នុងការធានាក្នុងពេលតែមួយ។ នៅក្នុងដំណើរការនៃការចម្លងបញ្ច្រាសគ្មាននរណាម្នាក់អាចធានាថានឹងទទួលបានបំណែកវែងសម្រាប់ហ្សែនចម្លងទាបជាពិសេសដោយប្រើអូលីហ្គូឌីធីធី។ ចំពោះយូធ្យូប ៥ អ៊ីញដែលមានជីអេសស៊ីកាន់តែច្រើនវាកាន់តែពិបាក។ ដូច្នេះវានៅតែជាវិធីសាស្រ្តសមហេតុផលក្នុងការបញ្ចូនប្រតិចារិកដោយប្រើបឋមបឋមចៃដន្យរកកន្លែងបំបែកធម្មជាតិនៅក្នុងបំណែកគោលដៅពង្រីកតាមផ្នែកហើយបន្ទាប់មកអនុវត្តការរំលាយអាហារនិងការដាក់កម្រិត។ ជាទូទៅវាពិបាកក្នុងការពង្រីកដោយផ្ទាល់នូវបំណែកធំជាង ២ គីឡូបៃប៉ុន្តែវាមិនតែងតែអាចទទួលបានទេ៖ ១. ដំបូងបង្អស់ធានានូវសុចរិតភាពនៃ RNA/mRNA ហើយការទាញយក TRIZOL ត្រូវបានគេពេញចិត្ត។ 2. ឧបករណ៍អេមអិល-អិលវី RT-PCR អាចត្រូវបានប្រើដោយផ្ទាល់។ ពង្រីកពេលវេលាដុតនិងបង្កើនចំនួនវដ្តនៅក្នុងដំណើរការពង្រីកឱ្យបានត្រឹមត្រូវ។ ម៉្យាងទៀត PCR ដែលមានរាងសំប៉ែតអាចត្រូវបានគេអនុវត្តឬអនុវត្តប្រតិកម្មមួយឬពីរជាមុនសិនជាមួយនឹងការពន្យារពេលនិងការពន្យារពេលឱ្យបានសមស្របមុនពេលការពង្រីក PCR ធម្មតាដែលអាចជួយពង្រីកបំណែក។ យកចិត្តទុកដាក់ចំពោះភាពស្មោះត្រង់របស់ប៉ូលីមេរេស។ ៣. ឡុងតាកអាចប្រើក្នុង PCR ដើម្បីទទួលបានលទ្ធផលល្អ។ 4. ចំពោះកម្មវិធីបញ្ចេញប្រូតេអ៊ីនគួរប្រើប៉ូលីមេរេសដែលមានភាពស្មោះត្រង់ខ្ពស់។

មានឯកសារចម្លងបញ្ច្រាសពីរប្រភេទដែលផ្តល់ជូនដោយ TIANGEN៖ Quant/King RTase និង TIANScript M-MLV ។ ភាពខុសគ្នាសំខាន់រវាងពួកវាគឺចំនួនបញ្ចូលពុម្ព។ Quant គឺជា transcriptase បញ្ច្រាសតែមួយគត់ដែលខុសពី M-MLV ដែលប្រើជាទូទៅដែលបានមកពីវីរុសជំងឺមហារីកឈាម Moloney murine ។ Quant គឺជាប្រតិចារឹកបញ្ច្រាសដែលមានប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់ថ្មីដែលត្រូវបានបង្ហាញដោយវិស្វករ Escherichia coli ។ បរិមាណគឺសមរម្យសម្រាប់ពង្រីក RNA ៥០ ng-២ μgជាមួយសកម្មភាពចម្លងបញ្ច្រាសខ្ពស់និងទិន្នផលខ្ពស់។ បើប្រៀបធៀបជាមួយអេមអិលអឹមវីឬអេអឹមវីធម្មតាលក្ខណៈធំបំផុតរបស់ខនគឺថាវាមានភាពស្និទ្ធស្នាលយ៉ាងខ្លាំងជាមួយគំរូអរអេនអេហើយអាចបញ្ច្រាសគំរូស្មុគស្មាញដែលមិនចម្លងដោយមិនមានកំដៅកំដៅខ្ពស់។ សម្រាប់គំរូដែលមានមាតិកា GC ខ្ពស់ប្រសិទ្ធភាពបញ្ច្រាសគឺខ្ពស់ជាង។ ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយការចម្លងបញ្ច្រាសនេះមានសកម្មភាព RNase H ដែលអាចប៉ះពាល់ដល់ប្រវែងផលិតផលស៊ីឌីអេនអេ (សមស្របសម្រាប់គំរូ <៤.៥ ខេប) ។ សម្រាប់ប្រតិចារិកបញ្ច្រាសធម្មតាធីអ៊ីនគ្រីសអេមអិលអិលអិលបញ្ច្រាសត្រូវបានណែនាំ។ RTase នេះគឺជាអង់ស៊ីមដែលបានកែប្រែដែលមានសកម្មភាព RNase H ខ្សោយខ្លាំងដែលសមស្របសម្រាប់ការសំយោគ cDNA យូរ (> ៥ kb) ។

ការបញ្ចូនបញ្ច្រាសមួយជំហាននិងការពង្រីកអេកភីអេសត្រូវបានបញ្ចប់នៅក្នុងបំពង់តែមួយដោយមិនចាំបាច់បើកគម្របបំពង់រវាងការសំយោគស៊ីឌីអេនអេនិងការពង្រីកដែលជួយកាត់បន្ថយការចម្លងរោគ។ ដោយសារសំណាកស៊ីឌីអិនអេទាំងអស់ដែលទទួលបានត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការពង្រីកភាពរសើបគឺខ្ពស់ជាងដោយមានអប្បរមា ០.០១ ភី។ ចំពោះ RTPCR មួយជំហានដែលទទួលបានជោគជ័យថ្នាំ primers ជាក់លាក់ហ្សែនជាទូទៅត្រូវបានប្រើដើម្បីផ្តួចផ្តើមការសំយោគ cDNA ។ វិធីសាស្រ្តពីរជំហានគឺការចម្លងបញ្ច្រាសនិងការពង្រីក PCR ត្រូវបានអនុវត្តជាពីរជំហាន។ ការធ្វើប្រតិចារឹកបញ្ច្រាសដំបូងត្រូវបានអនុវត្តចេញពីគំរូ RNA ដើម្បីទទួលបាន cDNA ហើយ cDNA ដែលទទួលបានត្រូវទទួលរងនូវប្រតិកម្ម PCR មួយឬច្រើន។ វិធីសាស្ត្រពីរជំហានអាចប្រើអូលីហ្គូ (ឌីធី) ឬបឋមចៃដន្យដើម្បីណែនាំការសំយោគខ្សែទីមួយនៃស៊ីឌីអេនអេហើយអាចបញ្ច្រាសការចម្លងព័ត៌មានអេមអរអេនអេអេទាំងអស់ពីគំរូជាក់លាក់មួយ។