2 × Taq ផ្លាទីន PCR លាយ
និយមន័យសកម្មភាព
១ យូធីយូធីយូផ្លាទីនឌីអិនអេអេសប៉ូលីមេរ៉េសត្រូវបានកំណត់ថាជាចំនួនអង់ស៊ីមដែលត្រូវការដើម្បីបញ្ចូលឌីអិនអិនឌីអុកស៊ីនយូក្លូតអ៊ីដចំនួន ១០ nmol ទៅក្នុងសារធាតុដែលមិនអាចរំលាយអាស៊ីតបាននៅ ៧៤ អង្សាសេក្នុងរយៈពេល ៣០ នាទីដោយប្រើមេជីវិតឈ្មោលអេមអេមអេមអេមអេលជាគំរូ។
ការត្រួតពិនិត្យគុណភាព
ភាពបរិសុទ្ធដោយការរកឃើញអេសឌីអេស-ទំព័រគឺច្រើនជាង ៩៩%; មិនត្រូវបានរកឃើញសកម្មភាពរបស់នូសេនខាងក្រៅទេ។ ហ្សែនចម្លងតែមួយនៅក្នុងហ្សែនរបស់មនុស្សអាចត្រូវបានបង្កើនប្រសិទ្ធភាព មិនមានការផ្លាស់ប្តូរសកម្មភាពសំខាន់នៅពេលរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេលមួយសប្តាហ៍។
ប៉ារ៉ាម៉ែត្របច្ចេកទេសចម្បង
វាមានសកម្មភាព 5′-3 ′exonuclease និង 3′-5′ សកម្មភាព exonuclease ហើយភាពស្មោះត្រង់របស់វាគឺនៅជាប់នឹង Pfu polymerase ។ ការពង្រីកល្បឿនរបស់តាកផ្លាទីនូប៉ូលីមឺរេសគឺលឿនជាងភីហ្វមប៉ូលីមែរហើយប្រសិទ្ធភាពពង្រីកគឺខ្ពស់ជាង។ ផលិតផល PCR អាចត្រូវបានភ្ជាប់ដោយផ្ទាល់ទៅចុងផ្លុំឬក្លូនជាមួយវ៉ិចទ័រ TA ។ ប្រសិនបើប្រសិទ្ធភាពក្លូនត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរវាត្រូវបានគេណែនាំឱ្យសម្អាតជាមុនហើយបន្ថែមអាន់ឌ័រ ៣'-dA មុនពេលក្លូនចូលទៅក្នុងវ៉ិចទ័រធីអេ។
តាម៉ាផ្លាទីនម៉ាតម៉ិចមួយបំពង់ (វិញ្ញាបនប័ត្រផលិតផលបច្ចេកវិទ្យាខ្ពស់ថ្នាក់ជាតិ)
Ta The Taq Platinum MasterMix បានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវភាពជាក់លាក់និងភាពប្រែប្រួលនៃប្រតិកម្ម PCR ហើយអាចពង្រីកគំរូស្មុគស្មាញដែលមានមាតិកា GC ខ្ពស់រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនិងអ្វីៗផ្សេងទៀត។ ទាបជាង ២ ច្បាប់នៃគំរូគោលដៅអាចត្រូវបានពង្រីកដោយធានានូវលទ្ធផលពិសោធន៍ត្រឹមត្រូវ។
formula រូបមន្ត Taq Platinum MasterMix តែមួយគត់ដែលធ្វើឱ្យប្រព័ន្ធប្រតិកម្មទាំងមូលមានស្ថេរភាពហើយសកម្មភាពនឹងមិនត្រូវបានប៉ះពាល់ដោយការបង្កកម្តងម្កាលឬការរក្សាទុករយៈពេលយូរនៅ ៤ អង្សាសេឡើយ។
solution ដំណោះស្រាយលាយបញ្ចូលគ្នា PCR ដែលបានរៀបចំទុកជាមុនប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពនិងប្រសិទ្ធភាពអាចធ្វើឱ្យប្រតិបត្តិការរហ័សនិងសាមញ្ញកាត់បន្ថយអាំងតង់ស៊ីតេពលកម្មនិងកំហុសក្នុងការធ្វើគំរូ។ ការបង្កើននិងបង្កើនប្រសិទ្ធភាព PCR ដែលមានដំណើរការខ្ពស់ត្រូវបានរួមបញ្ចូលផងដែរដែលជួយកាត់បន្ថយតម្រូវការលើលក្ខខណ្ឌ PCR ។
product ផលិតផលនេះមានទាំងប្រព័ន្ធគ្មានសារធាតុពណ៌និងគ្មានសារធាតុពណ៌ ផលិតផលម៉ាស្ទ័រម៉ិចដែលមានសារធាតុពណ៌អាចត្រូវបានបាញ់ដោយផ្ទាល់បន្ទាប់ពី PCR ដោយមិនចាំបាច់បន្ថែមសតិបណ្ដោះអាសន្ន។
កម្មវិធី
វាអាចជំនួស Pfu polymerase ដើម្បីពង្រីកផលិតផលដែលមានភាពស្មោះត្រង់ខ្ពស់ពីគំរូស្មុគស្មាញដូចជាហ្សែនហើយវាសមស្របសម្រាប់កម្មវិធីដូចជាការក្លូនហ្សែនបញ្ចេញមតិការផ្លាស់ប្តូរទីតាំងជាក់លាក់និងការវិភាគនៃពហុនុយក្លេអ៊ែរតែមួយ (SNP) ។
ការប្រុងប្រយ័ត្នក្នុងការរចនាបឋម PCR៖
ប្រវែងបឋមគឺ ២០-២៥ ម។ ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយនៅពេលសម្តែង PCR បំណែកវែងប្រវែងបឋមគួរតែត្រូវបានកើនឡើងដល់ ៣០-៣៥ mer ។
■មិនមានការផ្គូផ្គងគ្នារវាងទ្រនាប់ទាំងពីរជាពិសេសសម្រាប់មូលដ្ឋាន ៣ ចុងក្រោយនៅចុង ៣ អ៊ីញ
content មាតិកា GC គួរតែមានពី ៥០-៦០%ហើយជៀសវាង GC ឬអេធីធីដែលសំបូរបែប។ ដើម្បីធ្វើឱ្យទ្រនាប់បឋមនិងពុម្ពជាប់បានល្អចៀសវាងរចនាសម្ព័ន្ធអេធីអឹមនៅចុង ៣ អ៊ីញ
■ជៀសវាងការប្រើថ្នាំ primer ដើម្បីបង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ។
■ជ្រើសរើសថ្នាំ primer ពីរដែលមានសីតុណ្ហភាព Tm នៅជិតគ្នា។
ការគណនាតម្លៃធីមនៃថ្នាំបឋមសម្រាប់ PCR៖
■នៅពេលដែល primer តិចជាង 20 mer: Tm = 2 ° C × (A+T)+4 ° C × (G+C) ។
■នៅពេលដែល primer លើសពី ២០ mer: Tm = 81.5+0.41 × (GC%)-600/L ដែល L ជាប្រវែងរបស់ primer
■កំណត់សីតុណ្ហភាពដុតនៅ (Tm-5) ° C ។
ការបញ្ចូលបឋម PCR
ការផ្តោតអារម្មណ៍ចុងក្រោយនៃសារធាតុបឋមអាចត្រូវបានជ្រើសរើសរវាង 0.1 μMនិង 1.0 μM។ ការផ្តោតអារម្មណ៍ primer ទាបពេកនាំឱ្យមានទិន្នផលទាបនៃផលិតផលពង្រីកខណៈពេលដែលការផ្តោតអារម្មណ៍របស់ primer ខ្ពស់ពេកងាយនឹងពង្រីកដែលមិនជាក់លាក់។ ជាធម្មតានៅពេលដែលចំនួននៃគំរូឌីអិនអេធំឬឌីអិនអេគំរូស្មុគស្មាញ (ដូចជាឌីណូណូហ្សែនរបស់មនុស្ស) ត្រូវបានប្រើជាគំរូនោះកំហាប់បឋមគួរតែទាបជាង។ នៅពេលចំនួនឌីអិនអេគំរូតូចឬឌីអិនអេគំរូធម្មតា (ឧទាហរណ៍ផ្លាស្មាឌីអិនអេ។
ផលិតផលទាំងអស់អាចត្រូវបានប្តូរតាមបំណងសម្រាប់អូអឹមឌី/អូអេស។ សម្រាប់ព័ត៌មានលម្អិត,សូមចុចសេវាកម្មផ្ទាល់ខ្លួន (អឹមឌី/អូអឹម)
  |
ប្រើឌីអិនអេហ្សែនជាគំរូដើម្បីពង្រីកបំណែក ១ គីប។ បន្ទាប់ពីប្រតិកម្ម PCR សូមយក ៥ អ៊ីលសម្រាប់ការរកឃើញអេឡិចត្រូលីត។ |
គំរូ A-1
template ពុម្ពមានផ្ទុកនូវសារធាតុមិនបរិសុទ្ធប្រូតេអ៊ីនឬតាឃ្យូអ៊ីនអ៊ីស្យូស។
■ភាពមិនត្រឹមត្រូវនៃពុម្ពគឺមិនពេញលេញទេ - បង្កើនសីតុណ្ហាភាព denaturation ត្រឹមត្រូវនិងពន្យារពេល denaturation ។
rad ការបំផ្លាញគំរូ —— រៀបចំគំរូឡើងវិញ។
A-2 Primer
quality គុណភាពអឹមមឺរ-សំយោគ primer ឡើងវិញ។
rad ការបំផ្លាញសារធាតុ Primer —— បញ្ជូលសារធាតុ primers ដែលមានកំហាប់ខ្ពស់ទៅជាបរិមាណតូចដើម្បីរក្សាទុក។ ជៀសវាងការកកនិងការរលាយច្រើនឬរយៈពេលយូរ ៤ អង្សាសេ។
design ការរចនាមិនត្រឹមត្រូវនៃ primers (ឧទាហរណ៍ប្រវែង primer មិនគ្រប់គ្រាន់, dimer បង្កើតឡើងរវាង primers ។
អេ-៣ មីលីក្រាម2+ការផ្តោតអារម្មណ៍
Mg2+ កំហាប់ទាបពេក - បង្កើនមីលីក្រាមត្រឹមត្រូវ2+ កំហាប់៖ បង្កើនប្រសិទ្ធភាពមីលីក្រាម2+ ការប្រមូលផ្តុំដោយប្រតិកម្មជាបន្តបន្ទាប់ពី ១ មីល្លីម៉ែត្រទៅ ៣ មីល្លីម៉ែត្រដោយមានចន្លោះពេល ០.៥ មីល្លីម៉ែត្រដើម្បីកំណត់មីល្លីមល្អបំផុត2+ ការផ្តោតអារម្មណ៍សម្រាប់គំរូនិង primer នីមួយៗ។
A-4 សីតុណ្ហភាពកំដៅ
temperature សីតុណ្ហាភាពចំហេះខ្ពស់ជះឥទ្ធិពលដល់ការចងទ្រនាប់ទ្រនាប់ទ្រនាប់និងពុម្ព។ - បន្ថយសីតុណ្ហភាពដុតនិងបង្កើនប្រសិទ្ធភាពលក្ខខណ្ឌដោយជម្រាល ២ អង្សាសេ
A-5 ពេលវេលាពន្យាពេល
extension រយៈពេលពន្យាពេលខ្លី - បង្កើនពេលវេលាបន្ថែម។
បាតុភូត៖ គំរូអវិជ្ជមានក៏បង្ហាញពីក្រុមតន្រ្តីលំដាប់គោលដៅផងដែរ។
ក -១ ការចម្លងរោគ PCR
■ឆ្លងកាត់ការចម្លងរោគនៃលំដាប់គោលដៅឬផលិតផលពង្រីក - ប្រយ័ត្នកុំដាក់បំពង់ដែលមានលំដាប់គោលដៅនៅក្នុងគំរូអវិជ្ជមានឬកំពប់វាចេញពីបំពង់ centrifuge ។ ទឹកថ្នាំឬឧបករណ៍គួរតែត្រូវបានស្វ័យប្រវត្តិដើម្បីកំចាត់អាស៊ីតនុយក្លេអ៊ែរដែលមានស្រាប់ហើយអត្ថិភាពនៃការចម្លងរោគគួរតែត្រូវបានកំណត់តាមរយៈការពិសោធន៍ត្រួតពិនិត្យអវិជ្ជមាន។
ination ការចម្លងរោគនៃសារធាតុ - - កំចាត់សារធាតុគីមីហើយរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាពទាប។
A-2 នាយករដ្ឋមន្រ្តីr
Mg2+ កំហាប់ទាបពេក - បង្កើនមីលីក្រាមត្រឹមត្រូវ2+ កំហាប់៖ បង្កើនប្រសិទ្ធភាពមីលីក្រាម2+ ការប្រមូលផ្តុំដោយប្រតិកម្មជាបន្តបន្ទាប់ពី ១ មីល្លីម៉ែត្រទៅ ៣ មីល្លីម៉ែត្រដោយមានចន្លោះពេល ០.៥ មីល្លីម៉ែត្រដើម្បីកំណត់មីល្លីមល្អបំផុត2+ ការផ្តោតអារម្មណ៍សម្រាប់គំរូនិង primer នីមួយៗ។
design ការរចនាបឋមមិនត្រឹមត្រូវហើយលំដាប់គោលដៅមានភាពដូចគ្នាជាមួយនឹងលំដាប់មិនកំណត់គោលដៅ។ —- ការរចនាបឋមឡើងវិញ។
បាតុភូត៖ ក្រុមតន្រ្តីពង្រីក PCR មិនត្រូវគ្នានឹងទំហំរំពឹងទុកទាំងធំឬតូចឬពេលខ្លះទាំងក្រុមតន្រ្តីពង្រីកជាក់លាក់និងក្រុមតន្រ្តីពង្រីកដែលមិនជាក់លាក់។
អេ-១ មេ
■លក្ខណៈពិសេសបឋមខ្សោយ
—- ការរចនាបឋមឡើងវិញ។
concentration កំហាប់បឋមខ្ពស់ពេក - បង្កើនសីតុណ្ហាភាព denaturation ត្រឹមត្រូវនិងពន្យារពេល denaturation ។
ក -២ មីលីក្រាម2+ ការផ្តោតអារម្មណ៍
លោក Mg2+ កំហាប់ខ្ពស់ពេក - កាត់បន្ថយកំហាប់ Mg2+ ត្រឹមត្រូវ៖ បង្កើនប្រសិទ្ធភាព Mg2+ ការប្រមូលផ្តុំដោយប្រតិកម្មជាបន្តបន្ទាប់ពី ១ មីល្លីម៉ែត្រទៅ ៣ មីល្លីម៉ែត្រដោយមានចន្លោះពេល ០.៥ មីល្លីម៉ែត្រដើម្បីកំណត់មីល្លីមល្អបំផុត2+ ការផ្តោតអារម្មណ៍សម្រាប់គំរូនិង primer នីមួយៗ។
អេ -៣ ប៉ូលីមេរ៉េសដែលអាចធ្វើឱ្យកម្តៅបាន
amount បរិមាណអង់ស៊ីមលើស - កាត់បន្ថយចំនួនអង់ស៊ីមឱ្យបានត្រឹមត្រូវនៅចន្លោះពេល ០.៥ យូ។
A-4 សីតុណ្ហភាពកំដៅ
temperature សីតុណ្ហាភាពនៃការផ្សាភ្ជាប់ទាបពេក-បង្កើនសីតុណ្ហភាពដុតដោយត្រឹមត្រូវឬប្រើវិធីដុតពីរដំណាក់កាល
វដ្ត A-5 PCR
cy វដ្ត PCR ច្រើនពេក - កាត់បន្ថយចំនួនវដ្ត PCR ។
អេ-១ មេ—— ភាពជាក់លាក់មិនល្អ —— រចនាឡើងវិញនូវថ្នាំ primer ផ្លាស់ប្តូរទីតាំងនិងប្រវែងរបស់ primer ដើម្បីបង្កើនភាពជាក់លាក់របស់វា។ ឬអនុវត្ត PCR ដែលមានសំបុក
អេ -២ គំរូឌីអិនអេ
—— ពុម្ពមិនសុទ្ធ —— សម្អាតពុម្ពឬដកឌីអិនអេជាមួយឧបករណ៍បន្សុទ្ធ។
អេ-៣ មីលីក្រាម2+ ការផ្តោតអារម្មណ៍
- មីង2+ កំហាប់ខ្ពស់ពេក - កាត់បន្ថយមីលីក្រាមឱ្យបានត្រឹមត្រូវ2+ កំហាប់៖ បង្កើនប្រសិទ្ធភាពមីលីក្រាម2+ ការប្រមូលផ្តុំដោយប្រតិកម្មជាបន្តបន្ទាប់ពី ១ មីល្លីម៉ែត្រទៅ ៣ មីល្លីម៉ែត្រដោយមានចន្លោះពេល ០.៥ មីល្លីម៉ែត្រដើម្បីកំណត់មីល្លីមល្អបំផុត2+ ការផ្តោតអារម្មណ៍សម្រាប់គំរូនិង primer នីមួយៗ។
អេ -៤ ឌីអិនធីភី
—— កំហាប់ dNTPs ខ្ពស់ពេក —— កាត់បន្ថយកំហាប់ dNTP ឱ្យបានសមស្រប
A-5 សីតុណ្ហភាពកំដៅ
- - សីតុណ្ហាភាពនៃការដុតទាបពេក - បង្កើនសីតុណ្ហភាពដុតដោយត្រឹមត្រូវ
ក -៦ វដ្ត
—— វដ្តច្រើនពេក —— បង្កើនចំនួនវដ្ត
ជំហានដំបូងគឺត្រូវជ្រើសរើសប៉ូលីមេរ៉េសដែលសមស្រប។ តាម៉ីប៉ូលីមែរស្យុងធម្មតាមិនអាចពិនិត្យឡើងវិញបានទេដោយសារខ្វះសកម្មភាព ៣-៥ 'ហើយភាពមិនត្រូវគ្នានឹងកាត់បន្ថយប្រសិទ្ធភាពផ្នែកបន្ថែមយ៉ាងខ្លាំង។ ហេតុនេះហើយបានជាតាម៉ីប៉ូលីមែរស្យុងធម្មតាមិនអាចពង្រីកបំណែកគោលដៅធំជាង ៥ គីឡូបៃប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពឡើយ។ Taq polymerase ជាមួយនឹងការកែប្រែពិសេសឬ polymerase ភាពស្មោះត្រង់ខ្ពស់ផ្សេងទៀតគួរតែត្រូវបានជ្រើសរើសដើម្បីបង្កើនប្រសិទ្ធភាពផ្នែកបន្ថែមនិងបំពេញតម្រូវការនៃការពង្រីកបំណែកវែង។ លើសពីនេះការពង្រីកបំណែកវែងៗក៏តម្រូវឱ្យមានការកែតម្រូវដែលត្រូវគ្នានៃការរចនាបឋមពេលវេលាកំណត់ពេលវេលាការពន្យារពេល pH បណ្តោះអាសន្ន។ ល។ ដើម្បីបងា្ករការបំផ្លាញគំរូពេលវេលានៃការបដិសេធនៅ ៩៤ អង្សាសេគួរតែត្រូវបានកាត់បន្ថយមកត្រឹម ៣០ វិនាទីឬតិចជាងនេះក្នុងមួយវដ្តហើយពេលវេលាដើម្បីបង្កើនសីតុណ្ហភាពដល់ ៩៤ អង្សាសេមុនពេលពង្រីកគួរតែតិចជាង ១ នាទី។ លើសពីនេះការកំណត់សីតុណ្ហភាពផ្នែកបន្ថែមនៅប្រហែល ៦៨ អង្សាសេនិងការរចនាពេលវេលាបន្ថែមយោងតាមអត្រា ១ គីប/នាទីអាចធានានូវការពង្រីកប្រសិទ្ធិភាពនៃបំណែកវែង។
អត្រាកំហុសនៃការពង្រីក PCR អាចត្រូវបានកាត់បន្ថយដោយប្រើឌីអិនអេប៉ូលីមែរជាច្រើនដែលមានភាពស្មោះត្រង់ខ្ពស់។ ក្នុងចំណោមតាមិលឌីអិនអេប៉ូលីមែរទាំងអស់ដែលបានរកឃើញរហូតមកដល់ពេលនេះអង់ស៊ីមភីហ្វូមានអត្រាកំហុសទាបបំផុតនិងភាពស្មោះត្រង់ខ្ពស់បំផុត (សូមមើលតារាងភ្ជាប់) ។ បន្ថែមពីលើការជ្រើសរើសអង់ហ្ស៊ីមអ្នកស្រាវជ្រាវអាចកាត់បន្ថយអត្រាផ្លាស់ប្តូរ PCR បន្ថែមដោយធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវលក្ខខណ្ឌប្រតិកម្មរួមទាំងការធ្វើឱ្យប្រសើរនូវសមាសភាពសតិបណ្ដោះអាសន្នការផ្តោតអារម្មណ៍នៃប៉ូលីមេរ៉េសដែលអាចទ្រាំទ្របាននិងបង្កើនចំនួនវដ្ត PCR ។
ប្រភេទផលិតផល
ហេតុអ្វីជ្រើសរើសអាមេរិក
ចាប់តាំងពីការបង្កើតឡើងរោងចក្ររបស់យើងបាននិងកំពុងអភិវឌ្ products ផលិតផលលំដាប់ពិភពលោកដំបូងគេដោយប្រកាន់ខ្ជាប់នូវគោលការណ៍
ដែលមានគុណភាពជាចម្បង។ ផលិតផលរបស់យើងទទួលបានកេរ្តិ៍ឈ្មោះល្អនៅក្នុងឧស្សាហកម្មនិងមានទំនុកចិត្តក្នុងចំណោមអតិថិជនថ្មីនិងចាស់។
- ទូរស័ព្ទ៖ +៨៦ ០១០-៥៩៨២២៦៨៨
- អគារលេខ ៥ លេខ ៨៦ ផ្លូវស៊ូងយីងខាងលិចសង្កាត់ចាងភីងទីក្រុងប៉េកាំង
- ប្រជាជន @tiangen.com
