TIANSeq RNA Frag/cDNA ម៉ូឌុលសំយោគ

នាពេលបច្ចុប្បន្ននេះបច្ចេកវិទ្យាលំដាប់លំដោយកម្រិតខ្ពស់ត្រូវបានផ្អែកលើបច្ចេកវិទ្យាលំដាប់បន្ទាប់។ ដោយសារប្រវែងនៃការអានបច្ចេកវិទ្យាបន្តបន្ទាប់ជំនាន់ក្រោយមានកំណត់យើងត្រូវបំបែកលំដាប់ប្រវែងទាំងមូលទៅជាបណ្ណាល័យដែលមានបំណែកតូចៗទៅជាលំដាប់។ យោងតាមតំរូវការនៃការពិសោធន៍តាមលំដាប់លំដោយផ្សេងៗគ្នាជាធម្មតាយើងជ្រើសរើសលំដាប់ដែលមានតែមួយរឺការបញ្ចប់ទ្វេ។ បច្ចុប្បន្នបំណែកឌីអិនអេនៃបណ្ណាល័យបន្តបន្ទាប់ជំនាន់ក្រោយជាទូទៅត្រូវបានចែកចាយក្នុងចន្លោះ ២០០-៨០០ ប៊ី។

ក) ឌីអិនអេមានគុណភាពអន់និងមានសារធាតុរារាំង។ ប្រើសំណាកឌីអិនអេដែលមានគុណភាពខ្ពស់ដើម្បីចៀសវាងការរាំងស្ទះដល់សកម្មភាពអង់ហ្ស៊ីម។

ខ) បរិមាណគំរូឌីអិនអេមិនគ្រប់គ្រាន់ទេនៅពេលប្រើវិធីសាស្រ្តគ្មាន PCR ដើម្បីសាងសង់បណ្ណាល័យឌីអិនអេ។ នៅពេលការបញ្ចូលឌីអិនអេដែលបែកខ្ញែកលើសពី ៥០ ង៉ងលំហូរការងារដោយគ្មានភីអេសអរអាចត្រូវបានអនុវត្តក្នុងកំឡុងពេលដំណើរការសាងសង់បណ្ណាល័យ។ ប្រសិនបើលេខចម្លងនៃបណ្ណាល័យមានកម្រិតទាបពេកដែលអាចតម្រៀបដោយផ្ទាល់បណ្ណាល័យឌីអិនអេអាចត្រូវបានពង្រីកដោយ PCR បន្ទាប់ពីភ្ជាប់អាដាប់ធ័រ។

គ) ការចម្លងរោគ RNA នាំឱ្យមានការគណនាបរិមាណឌីអិនអេដំបូងមិនត្រឹមត្រូវការចម្លងរោគ RNA អាចមាននៅក្នុងដំណើរការបន្សុត DNA ហ្សែនដែលអាចនាំឱ្យមានការគណនាបរិមាណឌីអិនអេមិនត្រឹមត្រូវនិងការផ្ទុកឌីអិនអេមិនគ្រប់គ្រាន់កំឡុងពេលសាងសង់បណ្ណាល័យ។ RNA អាចត្រូវបានយកចេញដោយការព្យាបាលជាមួយ RNase ។

ក -១

ក) បំណែកតូចៗ (៦០ ប៊ីភីភី-១២០ ប៊ីប) លេចចេញជាបំណែកតូចៗជាធម្មតាបំណែកអាដាប់ធ័ររឺឌីមឺរបង្កើតដោយអាដាប់ទ័រ។ ការបន្សុតដោយប្រើគ្រាប់ម៉ាញ៉េទិក Agencourt AMPure XP អាចកំចាត់បំណែកអាដាប់ធ័រទាំងនេះប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពនិងធានាគុណភាពតាមលំដាប់លំដោយ។

ខ) បំណែកធំ ៗ លេចឡើងនៅក្នុងបណ្ណាល័យបន្ទាប់ពីការពង្រីក PCR ទំហំនៃបំណែកឌីអិនអេបណ្ណាល័យនឹងកើនឡើង ១២០ ប៊ីភីបន្ទាប់ពីអាដាប់ធ័រត្រូវបានភ្ជាប់។ ប្រសិនបើបំណែកឌីអិនអេកើនឡើងលើសពី ១២០ ប៊ីភីភីបន្ទាប់ពីការភ្ជាប់អាដាប់ធ័រវាអាចបណ្តាលមកពីការបែងចែកបំណែកមិនប្រក្រតីនៃអំព្លីភីអេសអរច្រើនពេក។ ការកាត់បន្ថយចំនួនវដ្ត PCR អាចការពារស្ថានភាព។

គ) ទំហំមិនប្រក្រតីនៃបំណែកឌីអិនអេបណ្ណាល័យបន្ទាប់ពីភ្ជាប់អាដាប់ធ័រប្រវែងអាដាប់ធ័រនៅក្នុងឧបករណ៍នេះគឺ ៦០ ប៊ី។ នៅពេលដែលចុងទាំងពីរនៃបំណែកត្រូវបានភ្ជាប់ទៅនឹងអាដាប់ទ័រប្រវែងនឹងកើនឡើងតែ ១២០ ប៊ីបប៉ុណ្ណោះ។ នៅពេលប្រើអាដាប់ទ័រក្រៅពីឧបករណ៍ដែលផ្តល់ដោយឧបករណ៍នេះសូមទាក់ទងអ្នកផ្គត់ផ្គង់ដើម្បីផ្តល់ព័ត៌មានពាក់ព័ន្ធដូចជាប្រវែងអាដាប់ធ័រ។ សូមធានាថាលំហូរការងារនិងប្រតិបត្តិការពិសោធន៍អនុវត្តតាមជំហានដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងសៀវភៅណែនាំ។

ឃ) ទំហំបំណែកឌីអិនអេខុសប្រក្រតីមុនពេលភ្ជាប់អាដាប់ធ័រមូលហេតុនៃបញ្ហានេះអាចបណ្តាលមកពីលក្ខខណ្ឌប្រតិកម្មខុសកំឡុងពេលការបែងចែកឌីអិនអេ។ ពេលវេលាប្រតិកម្មផ្សេងៗគ្នាគួរតែត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការបញ្ចូលឌីអិនអេខុសៗគ្នា។ ប្រសិនបើការបញ្ចូលឌីអិនអេលើសពី ១០ ng យើងសូមណែនាំឱ្យជ្រើសរើសពេលវេលាប្រតិកម្ម ១២ នាទីជាពេលវេលាចាប់ផ្តើមដើម្បីបង្កើនប្រសិទ្ធភាពហើយទំហំបំណែកដែលផលិតនៅពេលនេះភាគច្រើនស្ថិតនៅចន្លោះពី ៣០០-៥០០ ប៊ី។ អ្នកប្រើប្រាស់អាចបង្កើនឬបន្ថយប្រវែងបំណែកឌីអិនអេរយៈពេល ២ ទៅ ៤ នាទីតាមតម្រូវការផ្ទាល់ខ្លួនដើម្បីបង្កើនប្រសិទ្ធភាពបំណែកឌីអិនអេតាមទំហំដែលត្រូវការ។

ក -២

ក) ពេលវេលាបែងចែកមិនត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរទេប្រសិនបើឌីអិនអេដែលបែកខ្ញែកតូចឬធំពេកសូមយោងទៅការណែនាំសម្រាប់ការជ្រើសរើសពេលវេលាបែងចែកដែលមានចែងនៅក្នុងការណែនាំដើម្បីកំណត់ពេលវេលាប្រតិកម្មហើយប្រើចំណុចពេលវេលានេះជាវត្ថុបញ្ជាបន្ថែមលើ ប្រព័ន្ធប្រតិកម្មដើម្បីពន្យារឬខ្លី ៣ នាទីដើម្បីធ្វើឱ្យការកែសំរួលត្រឹមត្រូវជាងមុនលើពេលវេលាបែកបាក់

ក -៣

ការបែងចែកទំហំខុសពីធម្មតានៃឌីអិនអេបន្ទាប់ពីការព្យាបាលការបែកខ្ចាត់ខ្ចាយ

ក) វិធីរលាយមិនត្រឹមត្រូវនៃសារធាតុបំបែកសារធាតុឬសារធាតុមិនត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាទាំងស្រុងបន្ទាប់ពីរលាយ។ កំចាត់សារធាតុរំញោចអង់ស៊ីមដែលមានការបែងចែក ៥ ×លើទឹកកក។ នៅពេលដែលរលាយហើយសូមលាយទឹកថ្នាំឱ្យរាបស្មើដោយរំអិលផ្នែកខាងក្រោមនៃបំពង់ថ្នមៗ។ កុំបញ្ចោញសារធាតុប្រតិកម្ម!

ខ) គំរូបញ្ចូលឌីអិនអេមាន EDTA ឬសារធាតុបំពុលផ្សេងទៀតការបំផ្លាញ់អ៊ីយ៉ុងអំបិលនិងភ្នាក់ងារក្លែងបន្លំនៅក្នុងជំហានបន្សុត DNA មានសារៈសំខាន់ជាពិសេសសម្រាប់ជោគជ័យនៃការពិសោធន៍។ ប្រសិនបើឌីអិនអេត្រូវបានរំលាយនៅក្នុង 1 × TE សូមប្រើវិធីដែលមាននៅក្នុងការណែនាំដើម្បីអនុវត្តការបែងចែក។ ប្រសិនបើកំហាប់អេឌីធីអេនៅក្នុងដំណោះស្រាយមិនច្បាស់លាស់វាត្រូវបានគេណែនាំឱ្យសម្អាតឌីអិនអេហើយរំលាយវានៅក្នុងទឹកដែលមានជាតិអ៊ីយ៉ូដសម្រាប់ប្រតិកម្មជាបន្តបន្ទាប់។

គ) ការគណនាបរិមាណឌីអិនអេដំបូងមិនត្រឹមត្រូវទំហំនៃឌីអិនអេដែលបែកខ្ញែកទាក់ទងយ៉ាងជិតស្និទ្ធទៅនឹងបរិមាណបញ្ចូលឌីអិនអេ។ មុនពេលការព្យាបាលការបែកខ្ចាត់ខ្ចាយការធ្វើឱ្យមានភាពត្រឹមត្រូវនៃឌីអិនអេដោយប្រើឃូប៊ីតភីកហ្គ្រីននិងវិធីសាស្រ្តផ្សេងទៀតគឺចាំបាច់ដើម្បីកំណត់ចំនួនឌីអិនអេពិតប្រាកដនៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម។

 ឃ) ការរៀបចំប្រព័ន្ធប្រតិកម្មមិនអនុវត្តតាមការណែនាំការរៀបចំប្រព័ន្ធប្រតិកម្មដែលបែកបាក់ត្រូវតែអនុវត្តលើទឹកកកយ៉ាងតឹងរ៉ឹងតាមការណែនាំ។ ដើម្បីធានាបាននូវប្រសិទ្ធភាពល្អបំផុតសមាសធាតុប្រតិកម្មទាំងអស់គួរតែត្រូវបានដាក់នៅលើទឹកកកហើយការរៀបចំប្រព័ន្ធប្រតិកម្មគួរតែត្រូវបានអនុវត្តបន្ទាប់ពីត្រជាក់ទាំងស្រុង។ បន្ទាប់ពីការរៀបចំត្រូវបានបញ្ចប់សូមវាយឬបំពង់ដើម្បីលាយយ៉ាងហ្មត់ចត់។ កុំវង្វេង!

១. វិធីសាស្ត្រលាយមិនត្រឹមត្រូវ (វង់ទិក, លំយោលហឹង្សា។ ល។ ) នឹងបណ្តាលឱ្យការបែងចែកបំណែកបណ្ណាល័យមិនប្រក្រតី (ដូចបង្ហាញក្នុងរូបភាពខាងក្រោម) ដូច្នេះប៉ះពាល់ដល់គុណភាពបណ្ណាល័យ។ ដូច្នេះនៅពេលរៀបចំដំណោះស្រាយប្រតិកម្មហ្វ្រេហ្គេតមេនសិនសូមលាយថ្នមៗលើចុះក្រោមដើម្បីលាយឬប្រើចុងម្រាមដៃវាយនិងលាយ ឲ្យ ស្មើគ្នា។ ប្រយ័ត្នកុំលាយជាមួយវឺរ។

២. ឌីអិនអេដែលមានភាពបរិសុទ្ធខ្ពស់ត្រូវប្រើសម្រាប់ការសាងសង់បណ្ណាល័យ

integrity សុចរិតភាពឌីអិនអេល្អ៖ ក្រុមអេឡិចត្រូលីតមានទំហំលើសពី ៣០ គីបដោយគ្មានកន្ទុយ

OD260/230:> ១.៥

■អូឌី ២៦០/២៨០៖ ១.៧-១.៩

3. ចំនួនបញ្ចូលឌីអិនអេត្រូវតែមានភាពត្រឹមត្រូវវាត្រូវបានគេណែនាំឱ្យប្រើវិធីឃ្យូប៊ីតនិងភីកូហ្គ្រីនដើម្បីកំណត់បរិមាណឌីអិនអេជាជាងណាណូដាប់។

4. ខ្លឹមសារនៃអេឌីធីអេនៅក្នុងដំណោះស្រាយឌីអិនអេត្រូវកំណត់ថាអេឌីធីអេមានឥទ្ធិពលយ៉ាងខ្លាំងចំពោះប្រតិកម្មនៃការបែងចែក។ ប្រសិនបើខ្លឹមសាររបស់អេឌីធីអេខ្ពស់ការបន្សុតឌីអិនអេត្រូវអនុវត្តមុនពេលធ្វើតេស្តជាបន្តបន្ទាប់។

៥. ដំណោះស្រាយប្រតិកម្មនៃការបែកខ្ចាត់ខ្ចាយត្រូវតែរៀបចំនៅលើទឹកកកដំណើរការបែកខ្ចាត់ខ្ចាយមានភាពរសើបចំពោះសីតុណ្ហភាពនិងពេលវេលាប្រតិកម្ម (ជាពិសេសបន្ទាប់ពីបន្ថែមសារធាតុបន្ថែម) ។ ដើម្បីធានាបាននូវភាពត្រឹមត្រូវនៃពេលវេលាប្រតិកម្មសូមរៀបចំប្រព័ន្ធប្រតិកម្មលើទឹកកក។

៦. ពេលវេលាប្រតិកម្មនៃការបែងចែកត្រូវមានភាពត្រឹមត្រូវពេលវេលាប្រតិកម្មនៃជំហាននៃការបែកបាក់នឹងជះឥទ្ធិពលដោយផ្ទាល់ទៅលើទំហំនៃផលិតផលបំណែកដូច្នេះប៉ះពាល់ដល់ការបែងចែកទំហំនៃបំណែកឌីអិនអេនៅក្នុងបណ្ណាល័យ។

1. តើប្រភេទគំរូអ្វីដែលអាចអនុវត្តបានចំពោះឧបករណ៍នេះ?

ប្រភេទគំរូដែលអាចអនុវត្តបាននៃឧបករណ៍នេះអាចជា RNA សរុបឬ mRNA ដែលបានបន្សុតដោយមានសុចរិតភាព RNA ល្អ។ ប្រសិនបើអរអិនអិនសរុបត្រូវបានប្រើដើម្បីសាងសង់បណ្ណាល័យវាត្រូវបានគេណែនាំឱ្យប្រើឧបករណ៍បំលែងអរអរអេនអេនអេ (ឆ្មា#៤៩៩២៣៦៣/៤៩៩២៣៦៤/៤៩៩២៣៩១) ដើម្បីលុបអរអរអិនអេសិនជាមុនសិន។

2. តើសំណាកអេហ្វអេហ្វភីអេអាចប្រើដើម្បីសាងសង់បណ្ណាល័យជាមួយឧបករណ៍នេះបានទេ?

mRNA នៅក្នុងសំណាកគំរូអេហ្វអេហ្វភីអេនឹងត្រូវបានរិចរិលក្នុងកម្រិតជាក់លាក់មួយដោយមានសុចរិតភាពខ្សោយ។ នៅពេលប្រើឧបករណ៍នេះសម្រាប់ការសាងសង់បណ្ណាល័យវាត្រូវបានផ្ដល់អនុសាសន៍ឱ្យបង្កើនប្រសិទ្ធភាពការបែងចែកពេលវេលា (កាត់បន្ថយពេលវេលានៃការបែងចែកឬមិនអនុវត្តការបែងចែក) ។

៣. ដោយប្រើជំហានជ្រើសរើសទំហំដែលបានផ្តល់ជូននៅក្នុងសៀវភៅណែនាំផលិតផលតើអ្វីដែលអាចបណ្តាលឱ្យផ្នែកដែលបានបញ្ចូលបង្ហាញពីគម្លាតបន្តិចបន្តួច?

ការជ្រើសរើសទំហំត្រូវអនុវត្តយ៉ាងតឹងរ៉ឹងជាមួយជំហានជ្រើសរើសទំហំនៅក្នុងសៀវភៅណែនាំផលិតផលនេះ។ ប្រសិនបើមានគម្លាតពីគ្នាហេតុផលអាចមកពីអង្កាំម៉ាញ៉េទិចមិនមានតុល្យភាពទៅនឹងសីតុណ្ហភាពក្នុងបន្ទប់ឬមិនត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាយ៉ាងពេញលេញបំពង់បង្ហូរទឹកមិនត្រឹមត្រូវឬរាវនៅតែមាននៅក្នុងចុង។ វាត្រូវបានគេណែនាំឱ្យប្រើគន្លឹះជាមួយនឹងការស្រូបយកទាបសម្រាប់ពិសោធន៍។

៤. ការជ្រើសរើសអាដាប់ទ័រក្នុងការសាងសង់បណ្ណាល័យ

ឧបករណ៍សាងសង់បណ្ណាល័យមិនមានផ្ទុកអាដាប់ធ័រទេហើយវាត្រូវបានគេណែនាំឱ្យប្រើឧបករណ៍នេះរួមគ្នាជាមួយអាដាប់ធ័រលិបិក្រមទោល TIANSeq (Illumina) (៤៩៩២៦៤១/៤៩៩២៦៤២/៤៩៩២៣៧៨) ។

5. QC នៃបណ្ណាល័យ

ការរកឃើញបរិមាណបណ្ណាល័យ៖ Qubit និង qPCR ត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់កំហាប់ម៉ាស់និងកំហាប់ថ្គាមរបស់បណ្ណាល័យរៀងៗខ្លួន។ ប្រតិបត្ដិការគឺតឹងរ៉ឹងស្របតាមសៀវភៅណែនាំផលិតផល។ ការប្រមូលផ្តុំបណ្ណាល័យជាទូទៅនឹងបំពេញតម្រូវការនៃការរៀបចំលំដាប់អេនជីអេស។ ការរកឃើញជួរនៃការបែងចែកបណ្ណាល័យ៖ ការប្រើប្រាស់ Agilent 2100 Bioanalyzer ដើម្បីរកមើលជួរចែកចាយបណ្ណាល័យ។

6. ការជ្រើសរើសលេខវដ្តនៃការពង្រីក

យោងតាមការណែនាំចំនួនវដ្ត PCR គឺ ៦-១២ ហើយចំនួនវដ្ត PCR ដែលត្រូវការគួរតែត្រូវបានជ្រើសរើសយោងតាមគំរូបញ្ចូល។ នៅក្នុងបណ្ណាល័យដែលផ្តល់ទិន្នផលខ្ពស់ការរីកធំធាត់ជាធម្មតាកើតឡើងក្នុងកម្រិតខុសៗគ្នាដែលត្រូវបានបង្ហាញដោយការកើនឡើងធំជាងបន្តិចបន្ទាប់ពីចំណុចខ្ពស់បំផុតនៃជួរគោលដៅក្នុងការរកឃើញអាហ្គីលេន ២១០០ ប៊ីយ៉ូអាណាឡឺហ្សឺឬកំហាប់ឃ្យូប៊ីដែលរកឃើញគឺទាបជាង qPCR ការពង្រីកកម្រិតស្រាលគឺជាបាតុភូតធម្មតាដែលមិនប៉ះពាល់ដល់លំដាប់បណ្ណាល័យនិងការវិភាគទិន្នន័យជាបន្តបន្ទាប់។

៧. Spikes លេចឡើងនៅក្នុងទម្រង់រកឃើញរបស់ Agilent 2100 Bioanalyzer

ការលេចឡើងនៃការកើនឡើងនៅក្នុងការរកឃើញជីវអេណាលឡាហ្សិន ២១០០ គឺដោយសារតែការបែកខ្ញែកមិនស្មើគ្នានៃសំណាកដែលជាកន្លែងដែលមានបំណែកកាន់តែច្រើននៅក្នុងទំហំជាក់លាក់ហើយនេះនឹងកាន់តែច្បាស់បន្ទាប់ពីការធ្វើ PCR ។ ក្នុងករណីនេះវាត្រូវបានណែនាំថាមិនត្រូវធ្វើការជ្រើសរើសទំហំទេពោលគឺកំណត់លក្ខខណ្ឌនៃការបែងចែកទៅ ៩៤ អង្សាសេរយៈពេល ១៥ នាទីនៅកន្លែងដែលការបែងចែកបំណែកតូចហើយប្រមូលផ្តុំហើយភាពដូចគ្នាអាចត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើង។